In 2020 haben wir einen Übersichtsartikel veröffentlicht, welcher einen Überbick über die jüngsten strukturellen und funktionellen Daten zum Cap-Snatching-Mechanismus von Bunyaviren gibt. Wir haben Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den im Nukleus replizierenden Influenzaviren und den im Zytoplasma replizierenden Bunyaviren beschrieben und noch offene Fragen zum Cap-Snatching-Mechanismus von Bunyaviren hervorgehoben: (1) Von welchen zellulären mRNAs wird das 5’-Cap gestohlen? (2) Wie binden Bunyaviren die RNA-Kappe? (3) Wo genau im Zytoplasma stehlen Bunyaviren die mRNA-Kappen? (4) Wie stellen Bunyaviren sicher, dass die viralen mRNAs an den Ribosomen der Wirtszelle in virale Proteine übersetzt werden?

Beim Prozess des Cap-Stehlens (Cap-snatching) wird ein kurzes, mit einem 5’-Cap versehenes Stück der Wirtszell-mRNA abgespalten und als Start der viralen mRNA-Synthese genutzt. Somit wird sowohl eine Endonuklease Domäne für die RNA-Spaltung benötigt als auch eine Cap-bindende Domäne, welche die Cap-Struktur der Wirtszell-mRNA bindet. Während der Cap-Snatching-Mechanismus für Influenzaviren bereits umfangreich untersucht wurde und beide Funktionen gefunden wurden, sind beim bunyaviralen Cap-Snatching-Mechanismus noch viele Fragen offen. Obwohl für die Bunyaviren eine Endonuklease bereits identifiziert wurde, konnte lange keine funtkionierende Cap-Bindungsaktivität festgestellt werden. In den vergangenen Jahren ist es uns gelungen durch Kristallstrukturen und biophysikalische Methoden die Existenz einer funktionstüchtigen Cap-Bindungsdomäne im bunyaviralen L-Protein zu beweisen. Die Cap-Bindungsdomäne der Bunyaviren ist dabei vom Aufbau her sehr ähnlich zur Influenzavirus Cap-bindenden Domäne mit einem zentralen β-Faltblatt über dem eine lange α-Helix verläuft. Die RNA-Kappe wird dabei zwischen zwei aromatischen Seitenketten gebunden.

Publikation:
Olschewski-Pavlita S, Cusack S, Rosenthal M. The Cap-Snatching Mechanism of Bunyaviruses. Trends Microbiol. 2020;28(4):293-303. doi:10.1016/j.tim.2019.12.006

Virale Proteine müssen untereinander, mit Proteinen der Wirtszelle sowie mit viraler RNA und anderen Biomolekülen gezielt interagieren, um eine erfolgreiche Vermehrung des Virus zu gewährleisten. Wir verwenden die native Massenspektrometrie als Methode zur Analyse von Protein-Protein- und Protein-RNA-Wechselwirkungen in Bunyaviren. Diese Methode erlaubt es, Proteine in ihrem nativen Zustand zu "wiegen". Wir wollen verstehen, wie virale Ribonukleopartikel (RNP) zusammengebaut und für den Zusammenbau neuer Viruspartikel rekrutiert werden. Das RNP ist ein wichtiger Bestandteil des Virus, da es die minimale Einheit für die virale Genomreplikation und Transkription in Zellen darstellt (siehe oben). Wir haben entdeckt, dass das virale Nukleoprotein N, wenn es auf kleine RNA-Fragmente trifft, seine Form verändert und mit anderen N-Proteinen interagiert. Der ursprünglich trimere, ringförmige N-Komplex zerfällt in Monomere, die an die RNA gebunden sind. Diese an die RNA gebundenen N-Proteine bilden dann größere Komplexe, die an RNPs erinnern. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass ein anderes virales Protein, das so genannte Z-Protein, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von RNA direkt mit N interagiert. Diese Wechselwirkung ist wichtig für die Rekrutierung von RNPs in neu entstehende Viruspartikel. Interessanterweise ist die Stärke dieser N-Z-Wechselwirkung in einem sauren Milieu geringer, ähnlich den Bedingungen, unter denen das Virus in unsere Zellen eindringt, was die Freisetzung der RNPs aus der Virushülle bei der Infektion neuer Zellen erleichtern könnte. Das Verständnis dieser Mechanismen der RNP-Bildung und -Rekrutierung ist wichtig für die Identifizierung potenzieller Ziele antiviraler Maßnahmen.

Publikation: Saenger L., Williams HM, Yu D., Vogel D. Kosinski J, Rosenthal M*, Uetrecht C*. An RNA to rule them all: Critical steps in Lassa virus ribonucleoparticle assembly and recruitment. BioRxiv DOI: 10.1101/2023.02.09.527830

Für unsere Untersuchungen produzieren wir das L-Protein des LASV in Insektenzellen mit Hilfe von Insektenviren. So können wir auf einer grundlegenden molekularen Ebene untersuchen, wie dieses multifunktionelle Multidomänenprotein das virale Genom vervielfältigt und die virale mRNA produziert. Wir haben verschiedene biochemische Tests entwickelt, die es uns ermöglichen, die vielfältigen Funktionen des L-Proteins zu untersuchen.

Das L-Protein synthetisiert RNA - dieser Prozess kann sowohl mit Hilfe von kurzen RNA-Fragmenten (Primern) gestartet werden als auch ohne Primer (de novo). Die RNA-Synthese benötigt Mangan-Ionen anstatt Magnesium-Ionen, wie es bei anderen Polymerasen üblich ist. Experimente mit unterschiedlichen kurzen Primern ergaben, dass es zwei Stellen für den Start der RNA-Synthese auf dem viralen Genom gibt und dass kurze RNA-Fragmente auf dem Matritzenstrang verschoben werden können. Diese Strategie wird als sogenannte „Prime-and-Realign“-Hypothese für die de novo Initiierung der RNA-Synthese vermutet. Außerdem konnten wir zeigen, dass das LASV Z-Protein die RNA-Produktion hemmen kann.

Wir konnten neun 3D-Strukturen des Lassa-Virus (LASV) L-Proteins mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie bestimmen. Jede Struktur zeigt das LASV-L-Protein in einem anderen Bewegungszustand (Konformation), was die nötige Flexibilität dieses Moleküle für seine vielfältigen Funktionen unterstreicht. Diese hohe Flexibilität ist auch der Grund, warum die Strukturbestimmung so schwierig war. Da sich flexible Bereiche relativ schnell bewegen, sind sie sehr schwer abzubilden und erscheinen verschwommen, wenn sie überhaupt sichtbar sind. Unser Wissen aus der vorangegangenen biochemischen Charakterisierung des LASV L-Proteins ermöglichte es uns, das L-Protein in mehreren Funktionszuständen zu stabilisieren, die während der Genomvervielfältigung relevant sind. Wir konnten hochaufgelöste Strukturinformationen darüber erhalten, wie das LASV L-Protein durch Wechselwirkungen mit der viralen RNA reguliert wird. Wir haben verschiedene Bindetaschen für die konservierten 3'- und 5'-Enden der Promotor-RNAs festgestellt und gezeigt, wie die vollständige Bindung des RNA-Promotors eine bestimmte Konformation hervorruft, bei der das 3'-Ende in die aktive Tasche der RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRP) zeigt. Während der frühen RNA-Elongationsphase und in Abwesenheit von viraler RNA wird die Endonukleaseaktivität des L-Proteins durch zwei verschiedene Peptide aus dem L-Protein gehemmt, während sie im Präinitiationsstadium nicht gehemmt wird. Im frühen Elongationsstadium ist ein RNA-Doppelstrang aus Matritzen-RNA und RNA-Produkt zusammen mit einem nicht hydrolysierbaren Nukleotid im aktiven Zentrum der Polymerase gebunden. Der gesamte C-terminale Bereich des L-Proteins, einschließlich der vermuteten Cap-Bindedomäne, ist dabei klar sichtbar. Diese Forschungsdaten verbessern unser mechanistisches Verständnis davon, wie dieses flexible und multifunktionale Protein aktiviert und reguliert wird.

Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Sin-Nombre-Virus-L-Proteins

Hantaviren sind zoonotische Viren, die weltweit verbreitet sind und beim Menschen schwere Krankheiten verursachen können. Ein bedeutendes Beispiel ist das Sin-Nombre-Virus (SNV), welches das in Nordamerika am weitesten verbreitete humanpathogene Hantavirus ist. Bis heute gibt es keine wirksamen Impfstoffe oder spezifische, von der FDA zugelassene Therapeutika für die Behandlung von Hantavirus-Infektionen. Die gezielte Suche nach Hemmstoffen für die virale Genomvervielfältigung und Transkription erfordert eine tiefgreifende Kenntnis sowohl der Struktur als auch der Funktion des multifunktionalen L-Proteins. Wir haben Protokolle für die Expression und Reinigung des SNV L-Proteins sowie verschiedene biochemische Tests zur Untersuchung seiner Schlüsselfunktionen etabliert: (i) RNA-Abbau, katalysiert durch die Endonuklease, (ii) Bindung an die virale RNA und (iii) RNA-Synthese, katalysiert durch die RdRp. Darüber hinaus haben wir mittels Kryo-EM ein Strukturmodell des L-Proteins, einschließlich der RdRp, im Komplex mit dem viralen 5′-RNA-Ende erstellt.

Publikationen:
Meier K, Thorkelsson SR, Durieux Trouilleton Q, Vogel D, Yu D, Kosinski J, Cusack S, Malet H, Grünewald K, Quemin ERJ, Rosenthal M. Structural and functional characterization of the Sin Nombre virus L protein. PLoS Pathog. 2023 Aug 7;19(8):e1011533. doi: 10.1371/journal.ppat.1011533.